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Determinación del factor Rh por PCR

El objetivo de este experimento es la determinación del Rh utilizando para ello las técnicas de la PCR y de la electroforesis de ADN. Para ello, aislaremos el ADN de nuestra saliva y lo utilizaremos para llevar a cabo la reacción de PCR. La base de esta práctica es la amplificación de un fragmento del gen D. Los individuos Rh + producirán dos fragmentos de diferentes tamaños, mientras que los individuos Rh - producirán un único fragmento.
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15.Verter el sobrenadante en un tubo con 600 microlitros de isopropanol. Mezclar suavemente por inversión del tubo unos 40 - 50 veces.

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María del Rocío Vargas

27. Al terminar la electroforesis, llevar la placa de agarosa al transiluminador y enfocamos las bandas de ADN y leemos los resultados.

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25. cargamos en el primer pocillo de la placa de agarosa (con la mezcla anteriormente preparada). Añadimos en la placa de agarosa C+, C- y la muestra.

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24.12 microlitros de marcador + 3 microlitros de tampón de carga.

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23. Llenar la cubeta con el tampon comprobando que el tampon cubre completamente la placa

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22. Preparación del tampón TBE-5X (En un vaso de precipitado de 1000 mL y con ayuda de un imán disolver los reactivos. Al disolver los reactivos, se echa todo en una probeta).Hacemos la preparación de gel de agarosa añadiendo por último 16 microlitros de SYBR - green.

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21.Pasar los tubos al termociclador, que previamente ha sido programado de acuerdo con los siguientes valores: 10 minutos a 95 ºC; 35 ciclos = 1 minuto a 95 ºC ; 1 minuto a 64 ºC ; 1 minuto a 72 ºC. 10 minutos a 72 ºC

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20-Marcar un tubo como C+, C- y M1, M2 y así sucesivamente. Dispensar en un tubo 0'2 mL: -Control negativo = 22'5 microlitros de mix PCR + 2'5 microlitros agua destilada. Mezclar bien. -Control positivo = 22'5 microlitros mix PCR + 2'5 microlitros C+. Mezcla bien. - Muestra 5= 22'5 microlitros mix PCR + 2'5 microlitros de ADN. Mezclar bien.

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19.Añadir 200 microlitros del reactivo hidratante y resuspendemos el pellet mediante pipeteo. Almacenar el ADN hidratado en el refrigerador conservado a -20 ºC.

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18.Añadir 600 microlitros de etanol e invertimos el tubo varias veces, hasta disolver el pellet de ADN. Centrifugar a 13000 - 16000 rpm durante 1 minuto. Eliminar el etanol con cuidado. Invertir el tubo sobre el papel absorbente limpio para eliminar el resto de líquido y dejar secar al aire unos minutos.

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